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一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉(zhuǎn)錄)

不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在總rna的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂;取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNase I進(jìn)行消化(因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑)。

二、DNAse I 消化樣品RNA 中的DNA

用DNase I 消化DNA

組份 加量

模板(RNA) 10ug

RNase Inhibitor 4ul

DNase I buffer 10ul

DNase I 10ul

DEPC處理H2O 至100ul

混勻，37℃ 90min

三、RNA瓊脂糖凝膠電泳

1.1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：

1) 稱取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS緩沖液和39.5ml的DEPC水，放微波爐里溶化。

2) 待冷卻到60攝氏度左右時，加入1ml甲醛，搖勻(避免產(chǎn)生氣泡)。倒入凝膠板上凝固30min。

2.取各個RNA樣品4µl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2µl混勻，加入變性膠加樣孔中。

3.120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

4.RNA電泳結(jié)果如下圖所示?？梢?8S和18S兩條明亮條帶，無DNA條帶污染。

溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴(kuò)增。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期，其形狀是一條平滑的S型曲線。

如果在熒光背景信號階段出現(xiàn)很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì);

如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。

如果引物二聚體存在則陰性對照會出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免;

若是陰性對照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結(jié)果不可用。

在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：

① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計引物;

② 在做基因表達(dá)差異時容易出現(xiàn)DNA被擴(kuò)增峰(只在引物跨內(nèi)含子時存在)，出現(xiàn)原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA;

③ 擴(kuò)增非特異，這時要重新摸擴(kuò)增條件或重新設(shè)計并驗證引物。

九、表達(dá)差異的計算方法

定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算起始模板的拷貝數(shù);相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達(dá)差異之間的表達(dá)差異。

2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法。

在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量，只需要給出相對基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達(dá)量增加2.5倍比說該基因的表達(dá)從1000 拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。

2-△△CT方法的推導(dǎo)(詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達(dá)量)

補充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對樣品重新進(jìn)行氯仿抽提，具體實驗流程如下：

消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200ulDEPC水。

1. 向離心管中加入等體積氯仿(約300ul) ，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14000 rpm離心8min，取上清(約250ul)。

2. 加入1/10體積的NaAC(3M)(約25ul)和預(yù)冷的等體積異丙醇(約280ul)，-20℃放置20min。

3. 4℃14000 rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀。

4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm離心3min，去上清。

5. 瞬時離心，用200ul(或10ul)的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)(勿吸到管底的沉淀)。

6. 把離心管放置于超凈臺晾至約5-10 分鐘(勿*干燥，否則很難溶)。加入30~50μl的無RNase的水，靜止1min 后，振蕩30sec，瞬時離心。

7. 將提取的RNA立即進(jìn)行下游實驗，或放-20℃保存。

PCR實驗代做，MRNA實驗代測的整個操作流程詳解