雜交膜上有很多非特異性的蛋白質結合位點，為防止這些位點與抗體結合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質或非離子去污劑封閉膜上的未結合位點來降低抗體的非特異性結合。封閉劑應該封閉所有未結合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。zui常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST 或者TBST。

p 5%脫脂奶粉或BSA(室溫孵育1 h)

p western Blot 膜封閉液(生物試劑公司)

p Tween-20的作用：Tween-20是一種非離子型去污劑，有復性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。在做westen blot時，用惰性蛋白質或非離子去污劑封閉膜上的未結合位點可以降低抗體的非特異性結合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時，不破壞蛋白的結構，可減少對蛋白質之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如SDS則破壞蛋白的結構。

封閉劑選擇的特殊情況：

p 脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素。

p 如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。

p 檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。

一般封閉條件為：

室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2 h，特殊情況也可 4℃過夜。根據結果情況調整封閉試劑的濃度和類型。比如有時 BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。

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