PAg復(fù)合物制備方法簡(jiǎn)便，作為第二抗體，無(wú)種屬特異性，可以免去不同種屬動(dòng)物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg 復(fù)合物與包埋劑和細(xì)胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價(jià)的結(jié)合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復(fù)合物分子zui小易于穿透組織。PAg復(fù)合物的原液在4℃可保存達(dá)一年之久。電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標(biāo)記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白-PBs (pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液(pH7.4)來(lái)封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它的動(dòng)物的正常抗血清，因?yàn)镻Ag復(fù)合物能夠與正常血清組中的Ig結(jié)合，從而給出假陽(yáng)性結(jié)果;②在應(yīng)用*抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復(fù)合物孵育前的準(zhǔn)備時(shí)，應(yīng)用的PBS或TBS的pH應(yīng)變更為pH8.2.其它可參照本節(jié)中包埋后染色法進(jìn)行。

一、液體配制：

1、膠體金稀釋液配方：

(PH=8、2)的0.02mo1/L Tris TBS緩沖液，加入試劑級(jí)卵清白蛋白至1%。{免疫電鏡按1：20-50稀釋，淡紅色為適宜稀釋液，膠體金稀釋后應(yīng)于當(dāng)天使用，未用完的應(yīng)該丟棄。(免疫膠體金說(shuō)明書(shū))｝

2、清洗液：

0、5mol/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol/L Hcl約420m1，調(diào)pH值至7.4，zui后加雙蒸水至1000m1，此為儲(chǔ)備液。

0、05mo1/L Tris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;0.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1;加雙蒸水至1000m1，調(diào)pH值至7.4.

0、02mo1/LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;o.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至8.2.

3、H2O2的配制:3% H2O2

4、8%過(guò)碘酸鈉水溶液

5、封閉液：

前封閉液：1%卵白蛋白—0.05mo1/LTris緩沖液(pH7.4);

后封閉液以及膠體金稀釋液：1%卵白蛋白—0.02mo1/LTris緩沖液(pH8.2)，后封閉為膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備。

二、具體操作:

(一)包埋：

常規(guī)電鏡制樣，樣品只需要戊二醛固定，不需要鋨酸后固定。丙酮梯度脫水時(shí)70%的丙酮中沒(méi)有添加染色劑。樣品于37度烘箱中固化。

(二)切片：

超薄切片厚50～70nm左右，載于300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。

(三)抗原修復(fù)：

1、置1%H2O2內(nèi)10min至1h(視樹(shù)脂的硬度和切片的厚度而定)，以去鋨酸和增進(jìn)樹(shù)脂穿透性，有利抗體進(jìn)入。如切片很薄或于低溫包埋時(shí)，此步可省略。操作時(shí)，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過(guò)碘酸鉀(KIO4)代替H2O2的。

(同時(shí)用8%過(guò)碘酸鈉水溶液代替雙氧水，室溫5～25分鐘以及丙酮對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行溶解?？慈吣莻€(gè)效果)

2、雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當(dāng)壓力，但不宜過(guò)高強(qiáng)，用濾紙?jiān)诰W(wǎng)緣將水吸干。(0.05mo1/L TBS pH7.4洗5min×3次?)

三、封閉以及免疫反應(yīng)：

1、載有超薄片的鎳網(wǎng)或金網(wǎng)浮于1%卵白蛋白-TBS(7.4)液滴上，室溫約1h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。

2、載網(wǎng)直接移至*抗血清液滴上(抗體稀釋度較常規(guī)免疫組化低l倍)，在室溫孵育2h或4℃18～24h.

3、0、05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1/L TBS PH8.2，洗5min×3次。1%卵清白蛋白0.02mo1/L TBS(8.2) 37℃孵育l h，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余液體，不洗。

4、將PAg原液稀釋10～20倍(1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液)，載網(wǎng)浮于該液滴上，室溫孵育10min至1h(37℃孵育2h?)。

5、0、02mo1/L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。zui后切片浸于0.05m01/L TBS pH7.4緩沖液中，送電鏡室處理(含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分鐘?)。

四、電子染色以及電鏡觀察

1、5%醋酸鈾(雙蒸水配制)染5min，然后用雙蒸水洗。

2、枸櫞酸鈾(或醋酸鉛)染色5min，雙蒸水洗凈。

3、H-600透射電鏡觀察。

五、免疫膠體金試驗(yàn)成功的要求

抗體高度特異性和親和力以及被檢組織內(nèi)抗原含量高;標(biāo)本的前處理和染色也至關(guān)重要。

取消鋨酸后固定，聚合溫度不宜高于45度，可以選用37度12小時(shí)，45度48小時(shí)作為聚合溫度。試驗(yàn)全過(guò)程應(yīng)保持網(wǎng)面的濕潤(rùn)。緩沖液要清潔，用新鮮配制的或經(jīng)微孔濾紙過(guò)濾后使用。

染色前所用器皿必須清潔干凈且，并用雙蒸水沖洗三遍，染色程序中的洗滌必須充分，以減少背景染色。尤其雙重免疫標(biāo)記的切片染色時(shí)，*次金標(biāo)二抗孵育后必須充分洗滌，以不影響第二次金標(biāo)二抗的反應(yīng)結(jié)果。摘自:賈云香，卓夏陽(yáng)，顧云娣。雙重膠體金標(biāo)記的免疫電鏡技術(shù)。江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003,43(4):22-24

將免疫組織化學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，則可以利用電子顯微鏡高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，在超顯微結(jié)構(gòu)水平定位細(xì)腦內(nèi)的特異性抗原。為疾病的病因、發(fā)病機(jī)理、組織來(lái)源等方面的探索研究，為提高疾病的認(rèn)識(shí)與診斷提供可靠的手段。

六、附錄

1、試劑配制：

(1)4%多聚甲醛一0.01%戊二醛溶液：多聚甲醛4g，0.2m01/L二甲砷酸鈉緩沖液(內(nèi)含0.2mol/L蔗糖，0.4mmo1/L CaCl2)50 m1，20%戊二醛40ul，雙蒸水加至100m1.

(2)0、5mol/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol/L Hcl約420m1，調(diào)pH值至7.4，zui后加雙蒸水至1000m1，此為儲(chǔ)備液。

(3)0、05mo1/L Tris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;0.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1;加雙蒸水至1000m1，調(diào)pH值至7.4.

(4)0、02mo1/LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;o.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至8.2.

(5)0、5mo1/L，Triton-Tris緩沖生理鹽水：Tritonx-100 l0m1;0.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至7.4.

2、具體步驟:

(1)0、05mo1/L TBS(pH7.4)洗5min×3次。

(3)1：5正常羊血清(0.05mo1/L TBS PH7.4)37℃孵育l h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。

(4)特異性一抗(抗體稀釋度較常規(guī)免疫組化低l倍)室溫孵育24h.

(5)0、05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。

(6)0、02mo1/L TBS PH8.2，洗5min×3次。

(7)1：5正常羊血清(0.02mo1/L TBS pH8.2)37℃孵育l h，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。

(8)生物素化膠體金標(biāo)記二抗(原液)37℃孵育2h.

(9)0、02mo1/L TBS pH8.2，洗5min×3次。

(10)0、05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。

(11)zui后切片浸于o.05m01/L TBS pH7.4緩沖液中，送電鏡室處理。

無(wú)DNA酶的胰RNA酶 將胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl(PH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，與100度加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份-20度保存。

3、病毒液體的膠體金技術(shù)

(自：傅倉(cāng)生，膠體金免疫電鏡技術(shù)用于煙草花葉病毒的檢測(cè)，植物病理學(xué)報(bào)，VoL.24，No.4，353—355)1.3.1 外標(biāo)記標(biāo)本制備： (1)以帶膜銅網(wǎng)蘸取純化病毒懸液，PBS沖洗。(2)在相應(yīng)的抗血清中室溫孵育20分鐘，PBS沖洗。(3)在PAg(1：50稀釋)中室溫孵育20分鐘，PBS沖洗。(4)1%醋酸鈾負(fù)染，H500電鏡觀察，拍照。

內(nèi)標(biāo)記標(biāo)本制備： (1)以感染煙草花葉病毒的普通煙葉的試料，電鏡常規(guī)制樣，超薄切片。(2)在TMV抗血清中室溫孵育l小時(shí)，PBS沖洗數(shù)次。(3)在PAg(1：50稀釋)中室溫孵育1小時(shí)，PBS沖洗數(shù)次，三蒸水沖洗數(shù)次。(4)醋酸鈾一檸檬酸鉛雙染色，H500電鏡觀察，拍照。

(自：翟雷，樸曉萍，潘萍等。微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，1995，24(3)：17-19.免疫膠體金試劑的制備及應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒)取樣品100 ul分別于微量離心管，各加100 ul鼠抗HEV單克隆抗體(1：500一1000稀釋)，混勻， 37℃溫箱作用60min，雙蒸水充滿管，13000 rPm離心30 min，棄上清。沉淀用100 ul雙蒸水懸浮，加l00ul膠體金標(biāo)記免抗鼠IgG，溫勻，置37℃溫箱作用60 min.雙蒸水充滿管，13000rPm離心30min，棄上清，沉淀用l00ul雙蒸水懸浮，滴于鍍膜銅網(wǎng)，干后3%PH7.4的PTA負(fù)染，電鏡觀察。

(自：滴一滴NDV于銅網(wǎng)上，室溫吸附15分鐘，然后用0.1%的PBS洗5次，吸去余液;加一滴金標(biāo)抗體于銅網(wǎng)上，37度作用20分鐘，PBS洗5次，吸去余液，然后用磷鎢酸負(fù)染5分鐘，干燥后電鏡觀察。

(自：梁紅，譚紅英，蔡景霞等。蛋白A膠體金免疫電鏡負(fù)染技術(shù)檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒和SV40病毒，中華微生物和免疫學(xué)雜志，1998，9(2)：111-112) 取抗原抗體各50UL在血凝板孔中37度，45分鐘。加OD值為0.2膠體金50UL，37度，45分鐘。取抗原抗體膠體金混和物50UL，于銅網(wǎng)，室溫30分鐘。膠體金緩沖液洗兩次，雙蒸水洗一次，磷鎢酸負(fù)染，電鏡檢查。

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