生物通報(bào)道：多細(xì)胞生物的每個(gè)細(xì)胞都攜帶著相同的遺傳學(xué)信息。不過(guò)，近年來(lái)蓬勃發(fā)展的單細(xì)胞研究告訴我們，每一個(gè)細(xì)胞都是*的。不同類(lèi)型的細(xì)胞激活特定組合的機(jī)制，即使是同類(lèi)型細(xì)胞，基因表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)差異。

那么，細(xì)胞之間的哪些差異有生物學(xué)意義，哪些差異來(lái)自于技術(shù)偏好呢？要獲得的結(jié)果又需要研究多少細(xì)胞呢？這些問(wèn)題曾經(jīng)是單細(xì)胞研究（尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究）的攔路虎，令人望而卻步。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。

The Scientist雜志zui近了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專(zhuān)家，請(qǐng)他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫(kù)，處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。

上接：?jiǎn)渭?xì)胞研究指南：細(xì)胞分離

測(cè)序方法大比拼

在單細(xì)胞研究的大潮中，新的測(cè)序方法層出不窮。不過(guò)，很少有人對(duì)這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enardzui近團(tuán)隊(duì)，在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測(cè)序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。

Smart-seq

SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個(gè)具有里程碑意義的重要技術(shù)。實(shí)際上，能夠從單細(xì)胞生成全長(zhǎng)cDNA的測(cè)序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。對(duì)于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來(lái)說(shuō)，覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。

Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動(dòng)完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去，儀器就會(huì)分離并裂解細(xì)胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來(lái)測(cè)序，也可以進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

                        了解Fluidigm的C1單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)的更多信息

在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seqzui為靈敏，成本也zui高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用，不過(guò)這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實(shí)健康單細(xì)胞的存在。

斯坦福大學(xué)的學(xué)者Stephen Quake及其團(tuán)隊(duì)利用Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)，對(duì)大腦皮層的482個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，zui終得到了466個(gè)單細(xì)胞的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明，單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果不但能用于區(qū)分神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及血管細(xì)胞，還能將神經(jīng)元分為五類(lèi)興奮性細(xì)胞和兩類(lèi)抑制性細(xì)胞。（更多信息請(qǐng)參見(jiàn)：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，繪制人腦細(xì)胞圖譜）

CEL-seq

CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴(kuò)增的常用測(cè)序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢(shì)是錯(cuò)誤率比較低，不過(guò)線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。

CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年，主要是分離單細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細(xì)胞來(lái)源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類(lèi)似。

CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫(kù)花費(fèi)的時(shí)間要稍微長(zhǎng)一點(diǎn)。不過(guò)，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合，大大減少了手動(dòng)操作的時(shí)間。PCR是在zui后階段使用的，主要是為了連接正確的測(cè)序接頭，CEL-seq紐約大學(xué)的Itai Yanai介紹到。

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