現(xiàn)AR技術已廣泛應用于免疫組化(IHC)各領域的研究，例如在診斷病理學和IHC的標準化方面。對原來僅表達在冰凍切片上的抗原，利用AR后絕大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上，對IHC回顧性研究和病理IHC鑒別診斷，腫瘤患者術后的預后檢測及療效評估具有積極的意義。

一、 AR技術

加熱AR技術

微波加熱方法. 在傳統(tǒng)標準方法,經(jīng)脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧(化)物酶，石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘(注意防止切片干躁)。有時在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘(在*個5分鐘后檢測液體高度)。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體設定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件。

微波(MW)加熱過程如下：在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液(PH6.0±0.1)，并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰;將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國產(chǎn)家用微波爐(根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐)，中檔繼續(xù)處理10-20分鐘;取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次，之后用PBS(PH7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘。

盡管有少數(shù)作者[4]認為經(jīng)高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點，15分鐘的冷卻必須的幾點理由：1、如這一步省略，對于有些抗體而言，會降低AR-IHC染色強度。2、突然從高溫到低溫可導致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學的變化。

單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐(600W)上加熱至沸騰，并持續(xù)10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強度，顯示兩種方法導致相同的染色強度。

非加熱AR技術

非加熱AR技術包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵，修復抗原。

胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可;或由邁新提供的0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內(nèi)37oC溫箱中消化18-20分鐘。

胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4%的胃蛋白酶;

鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，濃度為o.1%，消化時間20min。

抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據(jù)不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內(nèi)抗原(如Fas、Bax、FⅧ等)和細胞間質抗原(如Laminin、CoIV等)則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標記效果更理想。

二、AR應注意的問題

加熱持續(xù)時間和強度是重要的影響因素之一，AR液的PH值、濃度、化學成分也是重要的影響因素之一。使用低PH值AR液必須使用陰性對照片，以防止定位不準[9]。Shi等人[10]強調修復緩沖液的PH值對某些抗原的修復十分重要,實驗中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結果必須選擇抗原修復液的zui適PH值。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC，采用不同濃度的Alcl3液做AR液，發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得的染色[11]。在修復的抗原中，金屬鹽可影響蛋白的結構。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修復抗原，發(fā)現(xiàn)其陽性強度逐漸增強。

高溫抗原修復因其機理相當復雜，對某些存在的問題很難用設計對照的方法加以解決，有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應，但在石蠟切片用抗原修復后卻能很好的顯示。對某些應表達在胞漿或表達在核內(nèi)的抗原，經(jīng)過量修復后，絕大部分表達在核內(nèi)，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表達在核內(nèi)的抗原經(jīng)過量修復會出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用該方法時一定小心，對結果的判斷也要客觀地作出分析，侯寧等人發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉錄酶(TRT)經(jīng)過抗原修復與不經(jīng)過抗原修復，其染色效果明顯不同，后者的陽性率明顯高于前者[8]。操作中還應注意如下問題：

1、熱處理后應注意自然冷卻。

2、熱處理時要防止切片干燥。

3、應根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復方法。

4、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。

5、注意形態(tài)學結構的改變(一般經(jīng)高溫修復后胞漿會明顯的破壞，而對細胞核的影響，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象，而經(jīng)酶水解的切片，其細胞漿破壞視消化時間而異，但核破壞較輕)。

6、如果在常用的緩沖液中無法實現(xiàn)抗原修復，或經(jīng)修復后抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或加一些螯合劑，如EDTA等可改善某些抗原的修復。

三、AR的標準化和發(fā)展

抗原修復的確切原理尚不十分清楚，根據(jù)國內(nèi)外文獻報道，推測可能是：1、溶解、洗脫變性蛋白。2、水解作用。3、微波場內(nèi)離子或極性分子直接碰撞的修復作用[7]?？乖迯褪欠窨赡?理論上研究尚未清楚，但是以高溫、高壓、對常規(guī)石蠟切片進行抗原修復處理經(jīng)驗表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率，同時也會出現(xiàn)假陽性。

診斷IHC上的AR技術及其在基礎領域的研究已被為數(shù)眾多的文獻和比較多的綜述所闡述。此領域的調查目的：從分子生物學診斷常規(guī)上，在石蠟組織中檢測核酸和蛋白質新途徑的可能性，從而形成新興的分子形態(tài)學。一些新的途徑必須建立標準化的原則和提高其重復性。[19] 。目前我國病理科大多數(shù)醫(yī)院病理科尚未在IHC、AR上標準化，國外已廣泛進行進行AR的標準化及IHC標準化[20]。例如在建立新的修復液方面，針對不同的抗體預定義加熱條件和液體濃度、PH值、化學成分，從而推動AR的標準化。

現(xiàn)AR技術已廣泛應用于免疫組化(IHC)各領域的研究，例如在診斷病理學和IHC的標準化方面。對原來僅表達在冰凍切片上的抗原，利用AR后絕大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上，對IHC回顧性研究和病理IHC鑒別診斷，腫瘤患者術后的預后檢測及療效評估具有積極的意義。

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