檢測(cè)各種魚(yú)

鱈魚(yú)及其制品中裸蓋魚(yú)、油魚(yú)和南極犬牙魚(yú)源性成分檢測(cè)
BJS 201907

1 范圍
本方法規(guī)定了鱈魚(yú)及其制品中裸蓋魚(yú)（Anoplopoma fimbria）、油魚(yú)（Lepidocybium flavobrunneum，Ruvettus pretiosus）和南極犬牙魚(yú)（Dissostichus eleginoides，Dissostichus mawsoni）源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
本方法適用于鱈魚(yú)、鱈魚(yú)片、鱈魚(yú)扒等生鮮或速凍鱈魚(yú)產(chǎn)品（不包含魚(yú)丸、魚(yú)糕、魚(yú)餅、魚(yú)腸、魚(yú)豆腐、魚(yú)肝油等加工產(chǎn)品）中裸蓋魚(yú)、油魚(yú)和南極犬牙魚(yú)源性成分的定性檢測(cè)。
2 原理
使用商業(yè)化DNA提取試劑盒，獲得適用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的DNA。分別使用裸蓋魚(yú)、油魚(yú)或南極犬牙魚(yú)特異性引物探針，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，獲得Ct值，根據(jù)Ct值判斷樣品是否檢出裸蓋魚(yú)、油魚(yú)或南極犬牙魚(yú)源性成分。
3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，本方法中所用試劑均為分析純，水應(yīng)符合GB/T 6682的一級(jí)水要求。試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器分裝。
3.1引物探針序列
3.1.1裸蓋魚(yú)源性成分NADH₂基因
裸蓋魚(yú)源成分5 ’端引物：5 ’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3 ’
裸蓋魚(yú)源性成分3 ’端引物：5 ’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3 ’
裸蓋魚(yú)源性成分探針：5 ’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3 ’
3.1.2油魚(yú)源性成分Cytb基因
油魚(yú)源性成分5 ’端引物：5 ’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3 ’
油魚(yú)源性成分3 ’端引物：5 ’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3 ’ 
油魚(yú)源性成分探針：5 ’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3 ’
3.1.3 南極犬牙魚(yú)源性成分CK基因
南極犬牙魚(yú)源性成分5 ’端引物：5 ’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3 ’
南極犬牙魚(yú)源性成分3 ’端引物：5 ’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3 ’
南極犬牙魚(yú)源性成分探針：5 ’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3 ’
3.1.4內(nèi)參照基因真核生物18SrRNA
內(nèi)參照5 ’端引物：5 ’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ’
內(nèi)參照3 ’端引物：5 ’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ’
內(nèi)參照探針：5 ’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3 ’
3.2 商業(yè)化DNA提取試劑盒。
3.3 商業(yè)化PCR反應(yīng)預(yù)混液。
4 儀器和設(shè)備
4.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。
4.2微量紫外分光光度計(jì)。
4.3恒溫水浴鍋。
4.4高速冷凍離心機(jī)：離心力18,000 g以上。
4.5微量移液器（0.5 μL- 10 μL，10 μL- 100 μL，20 μL- 200 μL，100 μL- 1000 μL）。
4.6 渦旋振蕩器。
4.7 天平：感量0.001 g。
5 分析步驟
5.1 樣品前處理
（1）樣品只有單塊魚(yú)肉組成：使用滅菌剪刀適量剪取中心部位魚(yú)肉。
（2）樣品有五塊以下魚(yú)肉組成：使用滅菌剪刀適量剪取每個(gè)組成部分的中心部位魚(yú)肉。
（3）樣品有五塊以上魚(yú)肉組成：隨機(jī)挑選5塊魚(yú)肉，使用滅菌剪刀適量剪取每個(gè)組成部分的中心部位魚(yú)肉。
將所取得的魚(yú)肉使用滅菌去離子水洗滌，離心去除上清液，盡可能剪碎并混勻。
注：速凍鱈魚(yú)產(chǎn)品應(yīng)在*解凍后再取樣。
5.2 DNA提取
按照商業(yè)化DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中要求的取樣量稱(chēng)取樣品，每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行，按照商業(yè)化DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
5.3 DNA濃度測(cè)定
取1 μL DNA溶液，使用微量紫外分光光度計(jì)按照dsDNA（雙鏈DNA）計(jì)算方式檢測(cè)其濃度。
5.4 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增
實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。
 

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 15 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s（讀取熒光），40個(gè)循環(huán)。
5.5 實(shí)驗(yàn)對(duì)照
分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、PCR空白對(duì)照、空白提取對(duì)照各一個(gè)。
陽(yáng)性對(duì)照：含相應(yīng)物種的DNA。
陰性對(duì)照：不含相應(yīng)物種的DNA。
PCR空白對(duì)照：以滅菌去離子水替代DNA加入實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系。
空白提取對(duì)照：以滅菌去離子水替代樣品進(jìn)行DNA提取。
6 結(jié)果判斷與表述
6.1 質(zhì)量控制
若以下條件的其中一條不滿(mǎn)足要求時(shí)，結(jié)果視為無(wú)效：
陽(yáng)性對(duì)照：熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0；
陰性對(duì)照：Ct值≥35.0；
PCR空白對(duì)照：Ct值≥35.0；
  空白提取對(duì)照：Ct值≥35.0；
內(nèi)參照反應(yīng)：熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0；
樣品平行反應(yīng)：Ct值經(jīng)6.2結(jié)果判定后應(yīng)一致。
6.2 結(jié)果判定
（1）如Ct值＜30.0，且質(zhì)量控制符合要求，則判定為檢出相應(yīng)物種源性成分。
（2）如Ct值≥30.0，且質(zhì)量控制符合要求，則判定為未檢出相應(yīng)物種源性成分。
6.3 結(jié)果表述
檢出 XXX 源性成分。
未檢出 XXX 源性成分。
7 防污染措施
檢測(cè)過(guò)程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的規(guī)定執(zhí)行。
8 方法檢出限
裸蓋魚(yú)引物探針檢出限范圍為0.1 %~5 %，油魚(yú)引物探針檢出限范圍為1 %~10 %，南極犬牙魚(yú)引物探針檢出限范圍為1 %~2 %。
注：因使用的設(shè)備、試劑盒不同，其檢出限有所差異。