測(cè)定意義

GOD（EC 1.1.3.4）廣泛存在于動(dòng)物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生H₂O₂，是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。

測(cè)定原理

GOD催化產(chǎn)生H₂O₂，過(guò)氧化物酶在有氧存在時(shí)催化H₂O₂分解產(chǎn)生的氧又將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質(zhì)，顏色深淺與葡萄糖氧化酶活性成線性關(guān)系。

試驗(yàn)中所需的儀器和設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制

提取液：液體×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體×1支，4℃保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備

組織處理：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

血清（漿）：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至500nm，蒸餾水調(diào)零。

2、GOD檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混勻，待用。

3、測(cè)定前將GOD檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、在EP管中加入10μL樣本和240μL工作液，立即混勻并計(jì)時(shí)，立即取200µL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中，記錄500nm下20s吸光值A1和1min20s后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

GOD活力單位的計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）GOD活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

GOD（U/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=3333×ΔA

2、動(dòng)物組織GOD活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

GOD（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T=3333×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

GOD（U/ g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V樣÷V樣總×W）÷T=3333×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.5×10^-4 L；ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺摩爾消光系數(shù)，7.5×10³mol/L/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）GOD活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

GOD（U/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6666×ΔA

2、動(dòng)物組織GOD活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

GOD（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T=6666×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

GOD（U/ g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V樣÷V樣總×W）÷T=6666×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.5×10^-4 L；ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺摩爾消光系數(shù)，7.5×10³mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。