長知識了！產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因竟然是這些

1、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。

2、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果;

5、 DAB孵育時間過長或濃度過高;

6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。

我的實際解決方案：

以上的分析可能對于初學(xué)者還是不容易的，下面我就把我的排除實驗的具體過程與大家進行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯，因此對于同樣組織的同一抗原進行分析，這種因素可以先排除。

2、其次，DAB孵育時間是否太長?做出來那一次我是孵育8min，后來也是8-10min，我單獨做了一次實驗來排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時間的延長，會出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后，血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min，所以我單獨做了一次實驗用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、此外，我在改進的同時，也對PBS清洗不斷地延長時間和增加次數(shù)，甚至*參照試劑盒說明書來進行操作(我以前一般一抗4度過夜且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、Sp反應(yīng)37度30min)，以及*滅活加強等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個實驗流程，與*次做出來相比，只有兩個地方做了改動：因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體，自我覺得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑)，其它步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點)，奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好。--因為抗原抗體反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，結(jié)果是前者偏酸性(<6、0)，而后兩者均在7、5左右。

6、看來主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問題了，于是又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對組織切片做了免疫組化，結(jié)果還是沒有做出來：背景很深。這真搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細(xì)分析：一抗一定是結(jié)合上去了(老SP試劑盒結(jié)果很好)，問題是二抗沒有結(jié)合上去也不對(因為zui后背景很深，這說明二抗可能也結(jié)合上去了)，DAB孵育時間現(xiàn)在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。

7、做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的，結(jié)果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來封閉血清也是罪會禍?zhǔn)字弧?/p>

結(jié)果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導(dǎo)致了我的免疫組化結(jié)果的不佳，望大家在以后的組化實驗中也要注意這兩個不太引人注意的關(guān)鍵問題。

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