免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測(cè)找信帆生物

信帆生物代做免疫熒光實(shí)驗(yàn)。老師提供樣本即可，我司可以進(jìn)行蠟塊切片可提供抗體等。免疫熒光檢測(cè)我們分單標(biāo)和雙標(biāo)。

在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測(cè)兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?。雙重免疫熒光標(biāo)記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測(cè)找信帆生物

冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟

1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來(lái)復(fù)溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮*干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

2、 修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1:9稀釋?zhuān)?/span>覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫孵育2小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm；FITC綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm）

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無(wú)水乙醇Ⅰ10min-無(wú)水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時(shí)間稍微延長(zhǎng)）。

2、 修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1:9稀釋?zhuān)?/span>覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm；FITC綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm）

實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀(guān)察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)使熒光提前衰退。

2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對(duì)照：

(1) 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物;

(2) 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物;

(3) 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物。

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