關(guān)于Western Blot實(shí)驗(yàn)操作時(shí)候的一些注意事項(xiàng)！

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常見(jiàn)問(wèn)題如下：

1、煮好后的樣品，若沒(méi)有及時(shí)上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久?

2、有沒(méi)有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒(méi)有操作手冊(cè)?

3、濕式轉(zhuǎn)移時(shí)是否必須要用bio-rad的濾紙?

4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定，因?yàn)槲乙蛛x小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎?

5、凝膠的濃度是不是可以用一個(gè)濃度?書(shū)上寫(xiě)不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個(gè)線形范圍，是不是不在這個(gè)范圍內(nèi)也能分離，只是就不是線性范圍了?

6、電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。

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解答：

1、煮好后的樣品，放到-20，我們?cè)谝粋€(gè)月后此樣品，效果一樣。

2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊(cè)在他們的主頁(yè)Bio-Rad USA上有。

3、轉(zhuǎn)移時(shí)一般的WATERMEN濾紙就可以。

4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的：以次確定電壓和時(shí)間。具體可讓ptglab幫你定奪。

5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。

6、電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓80-100伏。

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