Polymer雙染檢測試劑盒讓免疫組化染色如此簡單

規(guī)　　格： 6ml

試劑盒內(nèi)容：

試 劑 名 稱 規(guī) 格

試劑1 辣根酶標記山羊抗小鼠IgG聚合物 3ml

試劑2 堿磷酶標記山羊抗兔IgG聚合物 3ml

試劑3A DAB稀釋液（即用型） 6ml

試劑3B DAB濃縮液（20×） 0.5ml

試劑4A GBI—久紅底物液（即用型） 15ml

試劑4B GBI—久紅活化劑（5×） 3ml

試劑4C GBI—久紅色素底物（100×） 150μl

試劑5 Simpo—Mount封片劑 6ml

標本染色： 1. 固定：為確保能夠獲得高質(zhì)量和可重復(fù)性的染色結(jié)果，使用者必須提供經(jīng)恰當(dāng)固定和制備的組織切片。

2. 組織需使用經(jīng)過防脫片處理的載玻片以防染色過程中脫落。

3. 石蠟包埋的組織切片需經(jīng)過二甲苯脫蠟和逐級酒精脫水。

4. 細胞涂片需要盡可能為單層細胞，以期獲得滿意結(jié)果。

5. 三種對照片可對實驗結(jié)果的解讀有所幫助：陽性對照、試劑對照（使用同種型對照試劑）和陰性對照。

6. 免疫組化染色：從此步驟開始，不要讓切片干片。

7. 將切片放置于辣根酶和堿磷酶阻斷液（使用Klear Dual Enzyme Block E36）中孵育10分鐘，蒸餾水沖洗至少兩次。

8. 根據(jù)廠家所提供的一抗修復(fù)方式對組織切片進行修復(fù)，PBS（含0.05% Tween 20）或TBS-T沖洗，2分鐘×3次。

9. 封閉（可選擇）：對于石蠟切片，此步驟可改善染色結(jié)果；對于冰凍切片，可視固定方式酌情取舍。

10. 加入足夠量的兩種一抗混合物于切片上，濕盒中孵育，PBS（含0.05% Tween 20）或TBS-T沖洗，2分鐘×3次。注意：使用者必須在進行雙染之前確定合適的一抗稀釋度和孵育時間。

11. 將兩種二抗按照所需要的量等比例混合，充分混勻，每張切片加入50-100μl混合二抗，濕盒中孵育30分鐘，PBS（含0.05% Tween 20）或TBS-T沖洗，2分鐘×3次。

12. DAB染色:臨用前制備DAB工作液，在1ml試劑3A（DAB稀釋液）中，加入約50μl試劑3B（DAB濃縮液），混合均勻，即配成DAB工作液。此溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后避光保存，7小時內(nèi)用完。滴加足以覆蓋組織的上述DAB工作液，鏡下觀察顯色qin況，約需要5分鐘。蒸餾水沖洗以終止反應(yīng)，TBS-T沖洗，2分鐘×3次

13. GBI-久紅染色：在1ml的試劑4A（GBI—久紅底物液）中加入200μl的試劑4B（GBI—久紅活化劑，注意使用前搖勻），混勻，再加入10μl的試劑4C（GBI—久紅色素底物）于上述混合液中，再次混勻。如果一次使用量不多，也可按照上述比例配制合適量的顯色液。在每張切片上加入50-100μl或足以覆蓋組織的上述工作液，孵育10分鐘，鏡下觀察顯色qin況。為增強染色效果，可再次新鮮配制上述液體，并重復(fù)上述過程。蒸餾水沖洗終止顯色。注意：新鮮配制后立即使用，配制過程中注意將4B溶液搖勻后使用

14. 蘇木素復(fù)染：復(fù)染數(shù)秒，不要過染。自來水沖洗2-3分鐘。放入PBS中返藍（約0.5-1分鐘），去離子水沖洗。

15. 封片：滴加足夠量的試劑5（Simpo-Mount封片劑）覆蓋組織，輕輕旋轉(zhuǎn)切片使封片劑均勻平鋪覆蓋組織，不要加蓋玻片。

16. 水平放置切片，40-50℃烤箱中至少30分鐘或者室溫水平放置直到*變干，變硬的封片劑是一種保護屏障防止有機溶劑侵蝕顯色劑。

注意事項： 1. 固定方式和時間、組織切片厚度、抗原修復(fù)方式、一抗稀釋度和孵育時間等方面的因素都會對結(jié)果產(chǎn)生影響，在對實驗結(jié)果進行分析時使用者應(yīng)該充分考慮上述因素。

2. 假如需要加蓋蓋玻片，將已覆蓋上述變硬的封片劑的切片置于二甲苯中并立即取出，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片即可。

3. GBI-久紅不溶于有機溶劑，也可以用蓋玻片，但是脫水步驟必須短暫，以便信號不脫失。建議：

a) 80%酒精，20秒，一次

b) 95%酒精，20秒，一次

c) 100%酒精，20秒，三次

d) 100%二甲苯，20秒，1次

e) 加一滴二甲苯基質(zhì)的封片劑（建議使用GBI的O-Mount E02-18）并封片。注意輕壓以便排除氣泡。

4. DAB可能是致癌物質(zhì)，請采取必要的防護措施。

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