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上海信帆科技有限公司供應(yīng)供應(yīng)MMP-2 ，MMP-9活性檢測(cè)試劑盒（明膠酶譜法）試劑盒，明膠酶譜法試劑盒*，MMP-2/9基質(zhì)金屬蛋白酶試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒

MMP-2 and MMP-9明膠酶譜法試劑盒

描述：基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解

細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組

織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9

參與各種生理與病理過程，其在診斷和治療中的意義日益受到重視1。

本試劑盒采用酶譜法（zymography）檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基

于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA 方法2，其

基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電

泳， 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深

染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色

而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶譜）及活性。本試劑盒提供

MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-

9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15

個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750 個(gè)樣品。

適用: 檢測(cè)MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1

nM）。組成與儲(chǔ)存（50 assays）：

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；

2. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；

3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液）, 4 oC。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒

檢測(cè)步驟：

1. 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠：分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE

凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 oC 加熱5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加

入10 × substrate G 并使之稀釋10 倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer （用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM

Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue），混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅

使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽

性對(duì)照（可選步驟）：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing

buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml

1× Buffer A（用蒸餾水稀釋），室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5. 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B（蒸餾水稀釋），室溫或37oC 孵育1~5 小時(shí)。陽性

對(duì)照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時(shí)間為

10 小時(shí)或過夜。

6. 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見SDS-PAGE

凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置

不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶譜）及

活性。陽性對(duì)照將在66~72 （MMP-2）、92 （MMP-9）、130 （proMMP-9）、225 （proMMP-9） kDa

位置出現(xiàn)透明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決

辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑

色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

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說明

1. 10 mM 能夠EDTA *抑制MMP 活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置（#P2000）室溫快速干燥凝膠，作為*記錄保留。

參考文獻(xiàn)：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,

196–202

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒

常規(guī)考馬斯亮藍(lán)SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度

高，但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝

膠，并緩慢搖動(dòng)2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動(dòng)2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進(jìn)行脫色，直至獲得清晰的

藍(lán)色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈

的背景）；

4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對(duì)

凝膠進(jìn)行處理后保存。

安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。

說明：

1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍(lán)R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至1000ml，混合1h 后用

Whatman 1 號(hào)濾紙過濾，于室溫可無限期保存；

2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰醋酸；

4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用，裝入新容器內(nèi)，室溫或4 oC 保存，可反復(fù)使用2-4 次。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒