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COIP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，屬于免疫沉淀技術(shù)的一類，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。

服務(wù)說(shuō)明

1. 細(xì)胞培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞：100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中單層細(xì)胞長(zhǎng)滿80％-90％或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到2-5×10⁷個(gè)，懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到2-5×10⁷個(gè)）；
2. 加1ml（800uL）冰冷的 IP細(xì)胞裂解液到細(xì)胞培養(yǎng)皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】4℃裂解細(xì)胞10min，再用移液器反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中；
3. 用1ml(400uL)冰冷的IP細(xì)胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿，將殘留裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中；
4. 10000g、4℃離心細(xì)胞裂解懸浮液10min，將上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，冰上操作，然后測(cè)定蛋白濃度（取少量細(xì)胞裂解液變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白）；

選做：A.向細(xì)胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（與IP及COIP實(shí)驗(yàn)一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），4℃搖轉(zhuǎn)孵育30min；

1.       ℃離心細(xì)胞裂解液5min，將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的15ml離心管中，冰上操作，然后測(cè)定蛋白濃度（取少量細(xì)胞裂解液上清變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白）；
2.  

5.  取以上細(xì)胞裂解液上清1ml（或者100-500μg細(xì)胞總蛋白）到1.5ml離心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同時(shí)加相同量的與一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG作為陰性對(duì)照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具體一抗加入量根據(jù)IP級(jí)抗體使用說(shuō)明書進(jìn)行稀釋）

6.  再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），用手指輕輕彈勻，4℃搖轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜；

7.  4℃ 1000g離心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀復(fù)合物；

8.  將免疫沉淀復(fù)合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各種抑制劑）洗滌4次，每次4℃ 1000g離心5min，每次洗滌小心棄去上清；

9.  zui后一次洗滌之后，小心棄去上清后，加入40μL 1×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同時(shí)將一抗變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD）后4℃1000g離心5min取上清；

10. 取20μL上清樣品用于WB檢測(cè)（選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，可以大大減弱抗體分子的重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。）

實(shí)驗(yàn)材料：1.Agrose-proteinA/G：Santa  貨號(hào)：SC-2003

2.IP細(xì)胞裂解液配方：

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl（150mM）              8.766g

0.25％脫氧膽酸               2.5g

1％ NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加純水定容至1L。

COIP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

注意事項(xiàng)

1. 免疫共沉淀是建立在蛋白復(fù)合物成員間彼此緊密結(jié)合的基礎(chǔ)上，意味著松散結(jié)合的蛋白組分很可能檢測(cè)不到；

2. 由于蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以后，某些表位就會(huì)被掩蓋，因此可能導(dǎo)致使用某一種pull-down抗體，無(wú)論怎么增加抗體濃度，也極少能將不到一半的目標(biāo)蛋白復(fù)合物沉淀出來(lái)，如有必要使用多種不同抗體分別進(jìn)行CoIP；

3. 由于檢測(cè)的是天然狀態(tài)，因此在不同的時(shí)間和不同的處理下，CoIP拉下來(lái)的蛋白復(fù)合物都可能是不同的，當(dāng)然隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加，得到的蛋白復(fù)合物成員也會(huì)越來(lái)越龐大；

4. 如果使用Western Blot的方法檢測(cè)的蛋白復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白，則需要在試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)測(cè)，具有一定的冒險(xiǎn)性；當(dāng)然如果將蛋白復(fù)合物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析就不存在上述問(wèn)題，但需要得到較性價(jià)比高和濃度的蛋白復(fù)合物樣品也非易事，并且成本較高；

5. CoIP鑒定得到的蛋白間相互作用可能是直接作用也可能是間接作用，進(jìn)一步區(qū)分還需要進(jìn)行GST-Pull down等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；

6. 為了保證CoIP實(shí)驗(yàn)的可靠性和嚴(yán)謹(jǐn)性，需要使用復(fù)合物的不同成員分別獨(dú)立進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)，并且結(jié)果應(yīng)該能夠彼此驗(yàn)證，因?yàn)樵瓌t上使用復(fù)合物的任一成員進(jìn)行CoIP都會(huì)得到其他所有成員