免疫組化實(shí)驗(yàn)代測

免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。

免疫組化（IHC）技術(shù)通過計分法或灰度計量法也可以反應(yīng)抗原的表達(dá)量，但其特點(diǎn)在于切片制作過程中保持組織、細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)及形態(tài)，因此可以反應(yīng)目標(biāo)抗原在組織結(jié)構(gòu)中的分布以及亞細(xì)胞定位。組織細(xì)胞定位往往是生理功能發(fā)揮或變化的體現(xiàn)，是研究中常常關(guān)注的因素。

免疫組化實(shí)驗(yàn)說明：

1、免疫組化要做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

3、拍照倍數(shù)分100倍，200倍，400倍。正常情況下拍照是200倍3張，400倍3張。

4、全景掃描可看任意倍數(shù)。

免疫組化主要步驟:
1.洗載玻片: 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。

2.包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。

3.切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向*，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。

4.撈組織：當(dāng)組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，醉好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候醉好方向*，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。

5.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當(dāng)延長脫蠟時間,一般為12-15min.

6.抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的*酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來。

7.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。

8.加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實(shí)驗(yàn)，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。

9.加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。

10.加SABC: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。

11.加顯色劑: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液

12.復(fù)染: 將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。

13.脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。

14.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。
免疫組化的相關(guān)試劑：重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗，注意抗體的特異性、效價和交叉反應(yīng)。

免疫組化實(shí)驗(yàn)代測