抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染液

(Tartrate-Resistant Acid Phosphate stain)

[檢驗原理]

在酸性的緩沖液中，細胞內(nèi)酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物進而與一種穩(wěn)定的重氮鹽偶聯(lián),生成不溶性的偶氮染料沉淀，當(dāng)?shù)孜镏写嬖诰剖釙r，該反應(yīng)只出現(xiàn)在特異性細胞中。

[儲存條件及有效期]

本試劑盒室溫密封保存，有效期3 個月。所有應(yīng)用液配置后要立即使用，當(dāng)天一次用完。

[所需儀器]

光學(xué)顯微鏡、染缸、玻片、滴管、秒表、記號筆等。

O具體試劑配制及操作

一、固定液:液體，40mlx1 瓶

新鮮血涂片、細胞涂片或爬片、冰凍切片用固定液固定 5~10min。石蠟包埋的切片經(jīng)脫臘后不需要再固定。

二、底物反應(yīng)液(一) 、(二) 、(三) 、(四) 的組成及配制:

底物反應(yīng)液(一) 組成及配制

組成:(1) A粉x1 支(2) B 液500ulx1 支(3) C粉x1 支(4) D 液500ulx1 支

配制: 臨用前將 B 液用移液器吸入 A 粉中充分解配成甲液，備用再將 D 液移液器吸入 C粉中充分溶解配成乙液，備用最后將甲液與乙液混合成底物反應(yīng)(一)，備用

底物反應(yīng)液(二) 組成及配制:

組成:(1) E粉x1支(2) F 液 500ulx1 支

配制: 臨用前將底物反應(yīng)液二的 F 液移液器吸入 E 粉中充分溶解配成底物反應(yīng)液(二),備用。

底物反應(yīng)液(三): G液 lx1 支，備用

底物反應(yīng)液(四) 組成及配制:

組成：(1) H粉x1 支(2) I液 500ulx1 支

配制: 臨用前將 I液移液器吸入 H粉中充分溶解配成底物反應(yīng)液四，備用。

底物孵育液的配制:

染色缸染色孵育法:

1. 將底物反應(yīng)液(一)、(二)、(三)、(四)的備用液混合并充分混勻，

2. 先在染缸內(nèi)加 30 ml蒸餾水，37℃水浴 10 分鐘，

3. 將底物反應(yīng)液(一)、(二)、(三)、(四)依次加入已預(yù)溫的蒸餾水中,

4. 然后將樣本玻片固定，水洗后還末干前,，立即將樣本玻片放入已準(zhǔn)備好的反應(yīng)孵育液中，避光孵育 60 分鐘。

三、復(fù)染液:蘇木素液，10mlx1 瓶甲基綠液，10mlx1 瓶

孵育完后，取出水洗 1 分鐘，在玻片尚未干之前進行復(fù)染?？捎锰K木素復(fù)染 1-2 分鐘,或用甲基綠復(fù)染 2~3 分鐘，兩者取其一。

[樣本染色前處理及染色]

O 血涂片及骨髓涂片

1、推片: 取全血或骨髓3 微升左右置載玻片上，將推玻片保持與載玻片 30 度角，置于血滴正前方，稍往后移與血滴接觸，血滴沿推片下緣散開，再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向前滑動，至血液鋪完血膜為止。滿意效果為不太薄，以免細胞太少，也不要太厚，以免太重疊。

2、涼干:使涂片在空氣中自然涼干，再放入本試劑盒中的固定液內(nèi)固定 2~3 分鐘， 水洗約30-60 秒

3、一定注意水洗后不要太干時放入底物液中孵育 60 分仲 (太干后染色效果欠佳)

O石蠟切片

1、二甲苯中脫蠟 5-10 分鐘。再換用新鮮的二甲苯，脫蠟 5-10 分鐘

2、無水乙醇5 分鐘。再 90%、70%乙醇各2 分鐘。

3、水合:蒸餾水2 分鐘

O 冰凍切片

1、回溫: 將預(yù)先制作好的并保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫 約 5-10 分鐘。

注]:

①　可放到37C孵箱中進行回溫；

②　在 37℃水浴箱中放置一個小盒子，再將從冰箱中取出的切片架放到小盒當(dāng)中，目的是讓冰凍切片回溫到 37℃

2、水合:將回溫好的切片，水中浸泡 1~2 分鐘

[染色結(jié)果]

陽性反應(yīng)為鮮紅色或深紅色顆粒，定位胞漿。

抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染液