糖原（Glycogen）測(cè)定試劑盒

（比色法）

一、測(cè)定原理：

糖原（Glycogen）在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍

生物，后者再與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，與同法處理的標(biāo)

準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故在

顯色之前先將組織放入濃堿中加熱以破壞其它成分而保留糖

原。

二、試劑組成與配制：（50 管/48 樣）

試劑一：堿溶液，40mL×1 瓶，室溫或 2～8℃保存 6 個(gè)月。

試劑二：1mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液，1mL×1 支，室溫或 2～

8℃保存 6 個(gè)月。臨用前將 1mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品貯

備液∶雙蒸水=1∶99 的比例混合配成 0.01mg/mL 葡

萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天有效。

試劑三：顯色劑，粉劑×6 支，室溫或 2～8℃保存 6 個(gè)月。用

時(shí)每支加濃硫酸 25mL（濃硫酸自備），混勻，現(xiàn)用

現(xiàn)配。

顯色劑配制的注意點(diǎn)：

1、濃硫酸濃度必須 95%-98%的分析純并且不可開(kāi)瓶太久

（開(kāi)瓶放置太久，濃度會(huì)降低）。

2、配制顯色劑的容器和量筒必須干燥，否則會(huì)使試劑

三無(wú)法充分溶解。

3、配制顯色劑時(shí)：先將粉劑倒入燒杯中，然后加少量濃硫

酸（約 10mL），用玻棒壓碎粉劑，使其充分溶解，然

后再加入剩余的濃硫酸，充分?jǐn)嚢韬笫覝乇芄獗４妗?/span>

三、樣本前處理：

1、組織樣本處理：

① 取樣：取組織樣本（如肝臟或肌肉）用生理鹽水漂洗后，濾

紙吸干，稱重（樣本重量≤100mg 為宜，不要＞100mg）。

② 水解：按樣本重量（mg）∶堿液體積（μL）=1∶3，一起加

入試管中，沸水浴煮 20min，流水冷卻。

例如：肝臟組織稱重 75mg 按重量體積比 1∶3 應(yīng)加入堿

液的量為 225μL；肌肉組織稱重 85mg 按重量體積

比 1∶3 應(yīng)加入堿液的量為 255μL。

③ 將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測(cè)液：

肝糖原檢測(cè)液為 1%，加雙蒸水的量為：肝臟重量×100 - 肝

臟重量×4*=肝臟重量×96

肌糖原檢測(cè)液為 5%，加雙蒸水的量為：肌肉重量×20 - 肌

肉重量×4*=肌肉重量×16

注：4*為水解時(shí)堿液與組織的體積數(shù)。

例如上例：制備 1%肝糖原檢測(cè)液，加雙蒸水的量為：

75×96=7200μL =7.2 mL；制備 5%肌糖原檢測(cè)液，加雙蒸水

的量為：85×16=1360μL =1.36mL。

2、細(xì)胞樣本前處理：

① 細(xì)胞沉淀的收集（細(xì)胞數(shù)量在 100 萬(wàn)個(gè)以上）：

⑴、對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，直接取細(xì)胞懸液，1000rpm/分鐘

離心 10 分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀。

⑵、對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，用胰-酶將細(xì)胞消化下來(lái)，或用細(xì)

胞刮將細(xì)胞刮下來(lái)，制成細(xì)胞 懸液，1000rpm/分鐘 離

心 10 分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀。

② 細(xì)胞沉淀的洗滌：

在細(xì)胞沉淀中加入 0.5～1mL的緩沖液（0.1mol/L pH7～

7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水）， 輕輕混勻，1000rpm/分

鐘離心 10 分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀。

③ 水解：

⑴ 破碎后水解（適用于未知細(xì)胞數(shù)量或者細(xì)胞數(shù)量差異

較大的樣本）：細(xì)胞沉淀加入 0.2～0.5mL 緩沖液（0.1mol/L

pH7～7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水），冰水浴條件下超聲

破碎或手動(dòng)勻漿，不離心，直接取樣（取出部分測(cè)總蛋白

濃度，總蛋白濃度測(cè)定試劑盒本所有售，推薦 A045-3/-4，

BCA 法總蛋白測(cè)定試劑盒）0.05mL 加入堿溶液 0.15mL,

沸水浴 20 分鐘，流水冷卻，即為糖元檢測(cè)液。

⑵ 不破碎直接水解（適用于細(xì)胞總數(shù)相近或不考慮細(xì)胞

總數(shù)的樣本）：每管中加入堿溶液 0.225mL,沸水浴 20 分

鐘，流水冷卻，加雙蒸水 0.225mL，即為糖元檢測(cè)液。

附錄Ⅰ：脂肪肝樣本糖原測(cè)定

一、樣本前處理：

1、取樣：取新鮮肝臟樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱

重（樣本重量≤100mg 為宜，不要＞100mg）。

2、水解：按樣本重量（mg）∶堿液體積（μL）=1∶3，一起

加入試管中，沸水浴煮 20min，流水冷卻。

3、將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測(cè)液：

肝糖原檢測(cè)液為 5%，加雙蒸水的量為：

肝臟重量×20 - 肝臟重量×4*=肝臟重量×16

注：4*為水解時(shí)堿液與組織的體積數(shù)。

4、檢測(cè)液除脂：取上述制備好的檢測(cè)液（一般可見(jiàn)檢測(cè)液上

層漂浮有乳白色油狀物），加入一定量的氯仿，可

按照檢測(cè)液量(mL)：氯仿(mL)=4:1,漩渦混勻，3500

轉(zhuǎn)/分鐘離心 10 分鐘，取上清用于測(cè)定（如含量較高，

需稀釋后再測(cè)定）。

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