堿性磷酸酶（AKP）測試盒（微量酶標法）

（微量酶標法）

一、測定原理：

堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷酸，酚在

堿性溶液中與 4-氨基安替吡啉作用經鐵氰-化鉀氧化生成紅色

醌衍生物，根據紅色深淺可以測定酶活力的高低。

三、樣本采集及保存：

1、按常規(guī)采集樣本, 樣本可以是血清、血漿（肝素抗凝為佳）、

細胞培養(yǎng)上清。組織或培養(yǎng)細胞（按實驗方法學進行樣本前

處理，然后進行測定）。

2、如樣本收集后（如血清（漿）、組織、培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)上清等）

不能及時檢測，請將樣本放置于-20℃以下保存（溫度越低越

好）。

七、注意事項：

1、 如果所用的酶標儀沒有此波長，可以用相近的 510nm 或

者 530nm 波長均可，且 510nm 波長測定結果相對 530nm

更好。

2、 由于加樣量比較少，建議加樣時將吸頭靠近酶標板底部，

緩慢加樣，邊加邊將吸頭上移，以保證吸頭上樣本殘留

量最少，減少加樣方面存在的誤差。

3、 所加試劑接近于水劑，所以對吸頭的黏附性很小，但加

試劑時還是需要注意，速度不宜太快，以免濺出酶標孔

外。

4、 加樣或加試劑若靠壁加入則需靠近底部，前部分處理反

應液量比較少，若靠近上端加樣則會有部分黏附于酶標

孔上端。

5、 酶標孔比較小，所以混勻力度要適中，太劇烈則可能將

液體濺出，太慢則混勻不充分；先將孔壁上的液體輕輕

的震動落下，再前后、左右的搖動。

6、 一般對于酶標板可能存在初始吸光度的差異，在使

用之前先在相應的波長處測定其初始的吸光度，然后再

加樣測定。

7、 本試劑盒僅用于科研、實驗室。

8、 正式實驗前需要取 2 例預計差異的樣本進行預試，

若酶活力過高可將其稀釋后測定 OD 值控制在 0.2 或 0.3

左右，若酶活力較低，則直接測定或加大一倍取樣量后

測定。

附錄Ⅲ： AKP 標準曲線制作

一、樣本前處理：

將標準品貯備液用雙蒸水 50 倍，20 倍，10 倍，5 倍，2.5

倍，5/3 倍，1.25 倍稀釋及原液操作（濃度為 0.022 mg/mL、

0.055 mg/mL、0.11 mg/mL、0.22 mg/mL、0.44 mg/mL、0.66

mg/mL、0.88 mg/mL、1.1 mg/mL）

附錄Ⅳ： 培養(yǎng)液及培養(yǎng)細胞中 AKP 測定

一、樣本前處理：

1、細胞培養(yǎng)液：吸取培養(yǎng)液，1000-1500 轉/分鐘，離心 10 分鐘，

取上清液進行測定。

2、培養(yǎng)細胞前處理：

①、培養(yǎng)細胞的收集：

懸浮培養(yǎng)細胞：可直接通過離心收集沉淀細胞（1000 轉/

分鐘，離心 10 分鐘，棄上清留沉淀細胞）

貼壁培養(yǎng)的細胞：吸去上清，可通過細胞刮直接將細胞刮

下；或者是用 0.25%的胰-酶室溫消化 2～3 分

鐘，加培養(yǎng)液終止消化，用微量移液器輕輕

吹打，將所有液體吸出轉入 EP 管，然后 1000

轉/分鐘，離心 10 分鐘棄上清，留沉淀細胞，

再加入 1mL PBS 輕輕吹打，再次 1000 轉/分

鐘，離心 10 分鐘棄上清，留沉淀細胞待用。

如暫時不做，則可以將細胞沉淀物低溫凍存，

溫度越低越好。

②、培養(yǎng)細胞的破碎：

研磨破碎：在細胞沉淀中加入一定量（10 6的細胞一般加

0.3～0.5mL）的緩沖液（緩沖液可以用 PBS

或者是生理鹽水），用手動玻璃勻漿器冰水浴

研磨 3～5 分鐘，或者是用卡富隆電動研磨器

冰水浴研磨 3 分鐘待測；

超聲破碎：在細胞沉淀中加入一定量（10 6 的細胞一般加

0.3～0.5mL）的緩沖液（緩沖液可以用 PBS

或者是生理鹽水），需保證超聲探頭在液面以

下。功率 300W，冰水浴，每 3～5S 超聲一次，

間隔 4 次（每次間隔時間為 30S 左右）

化學裂解：貼壁培養(yǎng)的細胞，可直接將上清吸去后，直接

在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（覆蓋滿

細胞），裂解 30～40 分鐘（可用顯微鏡觀

察細胞破碎情況），再用微量移液器吸出待測。

根據需要可用生理鹽水或 PBS 進行一定的稀

釋。

堿性磷酸酶（AKP）測試盒（微量酶標法）