EK310HS-AW1

Rat IL-10 High Sensitivity ELISA Kit

檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）

Catalog Number

EK310HS - 48

EK310HS - 96

定量檢測血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的大鼠白細(xì)胞介素 10(IL-10)濃度。

本產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究，非診斷試劑，不能用于臨床診斷。

一、產(chǎn)品介紹

1. 背景介紹

白細(xì)胞介素 10 (IL-10)是由 2 個長 178 個氨基酸的亞基構(gòu)成的同源二聚體。在人類中，它由位于 1 號染色體的 IL-10 基因編碼，由 5 個外顯子組成。IL10 主要由單核細(xì)胞分泌，淋巴細(xì)胞、II 型輔助性 T 細(xì)胞 (Th2)、肥大細(xì)胞、

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞和部分活化的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞分泌較少。它對免疫調(diào)控和炎癥具有多種效應(yīng)。它下調(diào)巨噬細(xì)胞的 Th1 細(xì)胞因子、II 類 MHC 抗原和共刺激分子。它還能增強(qiáng) B 細(xì)胞存活、增殖和抗體分泌。

IL-10 能阻斷 NF-κB 活性，并參與 JAK-STAT 信號通路調(diào)控。IL-10 的免疫抑制特性提示其可能應(yīng)用于臨床，抑制器-官-移-植后的排斥。IL-10 還具有強(qiáng)烈的消炎特性。

2. 檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗大鼠 IL-10 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板

孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，經(jīng)過孵育，樣本中存在的 IL-10 與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入生-物-素

化的檢測抗體孵育。洗滌去除未結(jié)合的生-物-素化的抗體，加入辣根氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素 (Streptavidin-HRP)。洗

滌后，加入信號增強(qiáng)劑孵育，洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，再次加入 Streptavidin-HRP。洗滌后，加入顯色底物 TMB，避

光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中 IL-10 的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng)，在 450 nm 波長(參考波長 570 - 630 nm)

測定吸光度值。

3. 試劑盒檢測的局限

1) 請在本試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。

2) 試劑盒的試劑不能與其他批號的試劑或其他來源的試劑混合使用。

3) 任何標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、孵育溫度、試劑盒保存時間的改變，都將影響結(jié)合反應(yīng)。

4) 本試劑盒在設(shè)計上去除或降低了生物學(xué)樣本中的一些內(nèi)源性干擾因素，并非所有可能的影響因素都已經(jīng)去除。

二、基本信息

1. 試劑盒提供的材料

2. 未提供的材料設(shè)備

1) 能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長 570 nm 或 630 nm

2) 移液器及槍頭、加樣槽

3) 準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等

4) 蒸餾水或去離子水

5) 渦旋振蕩器、微孔板振蕩器

3. 貯存

試劑盒保存于 2 - 8℃，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上。只有恰當(dāng)保存的試劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用，

請確保上一次使用之后沒有被污染。

4. 注意事項

1) 所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害。

2) 推薦只有經(jīng)過良好實驗室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時請佩戴合適的防護(hù)設(shè)施，例如白大衣、乳膠手

套、安全眼鏡等。

3) 請避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

4) 試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護(hù)服，及防護(hù)眼睛、手及面部的設(shè)施。

5) 本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療。

6) 請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒中的試劑。

7) 請不要使用過期的試劑。

8) 在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強(qiáng)光照射。

9) 在操作試劑盒或處理樣本的區(qū)域請不要飲食。

10) 不要讓試劑或樣本接觸皮膚和粘膜。

11) 在操作試劑盒或處理樣本時請佩戴乳膠或一次性手套。

12) 顯色底物避免與氧化試劑和金屬接觸。

13) 避免氣溶膠的產(chǎn)生。

14) 為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。

15) 使用干凈的容器配制試劑。

16) 暴露于酸性環(huán)境會抑制結(jié)合。

17) 試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水。

18) 顯色底物在使用之前必須平衡至室溫（25℃±3℃）。

19) 樣本可能含有傳染性病原體，處理樣本和可能的污染材料的方法是 121.5℃，最少 1 小時。

20) 液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物，加入 1.0 %的次氯酸鈉，浸泡 30 分鐘。含酸的液體廢棄物，請先中和，

再加入次氯酸鈉。

21) 有時標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中可觀察到蛋白沉淀，該沉淀不影響使用，可以忽略。或者可通過 6,000 × g 離心 5 分鐘去除沉淀。

5. 技術(shù)要點

1) 重溶或者混合蛋白的時候，始終避免氣泡產(chǎn)生。

2) 避免交叉污染，在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品加樣、樣本加樣，以及不同試劑加樣的時候，請更換槍頭。不同的試劑，使用不同的

加樣槽。

3) 在應(yīng)用自動洗板機(jī)時，加入洗液之后，設(shè)置 30 秒的浸泡程序，或者在不同的洗滌步驟將微孔板掉轉(zhuǎn) 180 度，這樣可

以提高分析的準(zhǔn)確度。

4) 為保證結(jié)果的精確性，孵育時封好封板膜。

5) 顯色底物在添加之前應(yīng)是無色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài)。

6) 終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同。

7) 添加終止液之后，底物的顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如果底物呈現(xiàn)綠色，說明終止液與顯色底物沒有充分混勻。

8) 推薦所有的檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中設(shè)復(fù)孔。

9) 在任何情況下，避免接觸微孔板的內(nèi)表面。

三、 檢測步驟

1. 樣本采集與貯存

細(xì)胞培養(yǎng)上清

300 × g 離心 10 分鐘去除沉淀物，即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后，1,000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下

貯存。

血漿樣本

EDTA、枸櫞-酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。1,000 × g 離心 30 分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯

存。

本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清和血漿已經(jīng)過驗證。

注意：檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。不要使用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。樣本應(yīng)分裝并貯存于-20℃，以

避免大鼠 IL-10 活性的丟失。如果在 24 小時內(nèi)檢測。樣本可以存放在 2 - 8℃。

避免樣本的反復(fù)凍融。在檢測前，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫（25℃±3℃），輕柔地混勻。

2. 試劑準(zhǔn)備

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫（25℃±3℃）。

如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水至 1,000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 - 8℃貯存，

1×洗液可穩(wěn)定保存 30 天。

1×檢測緩沖液

吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水至 50 ml，輕輕混勻，避免泡沫。2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖

液可穩(wěn)定保存 30 天。

檢測抗體工作液

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢測抗體。

鏈霉親和素工作液

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的鏈霉親和素。

信號增強(qiáng)劑工作液

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的數(shù)量，用信號增強(qiáng)劑稀釋液按 1 ：100 稀釋濃縮的信號增強(qiáng)劑。

注意：檢測抗體工作液、鏈霉親和素工作液、信號增強(qiáng)劑工作液均應(yīng)在 30 分鐘內(nèi)使用。

樣本稀釋

為了保證實驗成功，由于對樣本的處理方式，培養(yǎng)條件等不同，建議使用本試劑盒前行一次預(yù)實驗以摸

索的樣本濃度，避免因濃度過高使顯色反應(yīng)超出酶標(biāo)儀的檢測上限或稀釋倍數(shù)過大低于試劑盒靈敏度。 對于樣本

的稀釋，請用 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清。

大標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

開蓋前短暫離心，用蒸餾水重溶標(biāo)準(zhǔn)品，重溶體積標(biāo)注于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶

后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 800 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋前充分混勻。

請使用聚丙烯管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。

血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取 230 μl 濃縮的標(biāo)準(zhǔn)品，加入 230 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度 (400 pg/ml)。在每一個試管中加入

230 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)曲

線的零濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取 230 μl 濃縮的標(biāo)準(zhǔn)品，加入 230 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度(400 pg/ml)。在每一個試管中加入 230 μl

細(xì)胞培養(yǎng)基。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，確保充分混勻。以細(xì)胞培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

3. 檢測步驟

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫（25℃±3℃）。

1) 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

2) 將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。

3) 浸泡酶標(biāo)板：加入300 μl 1×洗液靜置浸泡30 秒。為了獲得理想的實驗結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微

孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

4) 加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓准尤?/span> 100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基(細(xì)

胞培養(yǎng)上清樣本)。

5) 加樣本：血清/血漿：樣本孔加入 90 μl 1×檢測緩沖液和 10 μl 樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入 100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清。

保證步驟 4、5 連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在 15 分鐘內(nèi)完成。

6) 孵育：使用封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）孵育

1.5 小時。

7) 洗滌：棄掉液體，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗滌 6 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必

須移除殘留液體。

8) 加檢測抗體：每孔加入100 μl“檢測抗體工作液"(參見試劑準(zhǔn)備)。使用封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒

出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）孵育30 分鐘。

9) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

10) 加酶孵育：每孔加入 100 μl“鏈霉親和素工作液"(參見試劑準(zhǔn)備)

使用新的封板膜封板 100 300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每

孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）孵育 30 分鐘。

11) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

12) 加信號增強(qiáng)劑孵育：每孔加入 100 μl “信號增強(qiáng)劑工作液"(參見試劑準(zhǔn)備) 。使用新的封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/

分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）精確孵育 15 分鐘。

13) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

14) 再次加酶孵育：每孔加入 100 μl“鏈霉親和素工作液"(參見試劑準(zhǔn)備) 。使用新的封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保

證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）精確孵育 15 分鐘。

15) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

16) 加底物顯色：每孔加入 100 μl 顯色底物，避光，室溫（25℃±3℃）孵育 5 - 30 分鐘。

17) 加終止液：每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕

叩擊板框，充分混勻。

18) 檢測讀數(shù)：在 30 分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定 450 nm 吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長

下的 OD 值。校準(zhǔn)后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導(dǎo)致 OD

值偏高，并且準(zhǔn)確度降低。

如何控制標(biāo)曲顯色？(僅針對雙抗夾心法 ELISA 試劑盒)

5 - 30 分鐘顯色時間為經(jīng)驗范圍，每個具體的實驗，可根據(jù)以下情況，確定大致的顯色時間：

1) 肉眼觀察：標(biāo)曲 S5 孔有淡藍(lán)色、Blank 孔無明顯藍(lán)色時，即可終止；

2) 儀器判斷：630 nm 左右波長下，標(biāo)曲 S1 孔的 OD 值達(dá)到 0.5 - 0.7、S5 孔的 OD 值達(dá)到 0.05 - 0.08、Blank 孔的 OD

值小于 0.05 時，即可終止；

3) 高敏系列試劑盒因靈敏度更高，需嚴(yán)格控制顯色時長，可較普通試劑盒適當(dāng)縮短顯色時間。

四、分析

1. 結(jié)果計算

計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均 OD 值，然后減去零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，用計算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w分析確定擬合曲線。

通過對濃度值和 OD 值取對數(shù)擬合，可以對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確

度會降低一些。

注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點的終濃度為 400 pg/ml。

如果血清/血漿樣本按照說明書進(jìn)行稀釋，最終的稀釋倍數(shù)為 10。如果樣本進(jìn)行了其它方式的稀釋，計算樣本濃度

時請乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

2. 典型數(shù)據(jù)

每次檢測，每塊酶標(biāo)板都必須設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線。下面的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅作為示例參考。

3. 靈敏度

大鼠 IL-10 的可檢測濃度為 0.22 pg/ml (6 次獨(dú)立實驗的平均值)。

10 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩倍 SD，計算可檢測濃度。

4. 精密度

酶標(biāo)板內(nèi)精密度

3 個已知濃度的樣本酶標(biāo)板內(nèi)重復(fù)測定 20 次，評估酶標(biāo)板內(nèi)的精密度。

酶標(biāo)板間精密度

3 個已知濃度的樣本酶標(biāo)板間重復(fù)檢測 6 次，評估酶標(biāo)板間的精密度。

5. 回收率

5 份健康大鼠血清中加入 3 個不同濃度水平的大鼠 IL-10，未加大鼠 IL-10 的血清作為本底，計算回收率?；厥章实姆秶鷱?/span> 94 %至 115 %，平均回收率為 103 %。

6. 稀釋線性

5 份健康大鼠血清中加入高濃度的大鼠 IL-10，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線的動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行系列稀釋，評估檢測的線性。

本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品為聯(lián)科生物校準(zhǔn)的性價比高重組大鼠 IL-10。

8. 樣本值

應(yīng)用本試劑盒，檢測 30 份健康 SD 大鼠的血清樣本。

n.d. = 測不到濃度值。樣本的濃度值低于靈敏度被認(rèn)為測不到濃度值。

注意: 此樣本值范圍非生理值范圍。健康大鼠樣本的濃度范圍因種屬、樣本制備以及檢測人員、設(shè)備的不同而有所

不同。以上數(shù)據(jù)僅供參考。

9. 特異性

本試劑盒識別天然和重組大鼠 IL-10。下述因子進(jìn)行了特異性的評估，沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)和干擾影響。

 檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）