瓊脂糖-易洗脫重組鏈球菌蛋白G親和填料

1 、產(chǎn)品介紹

ee-ProGNUPharose FF是一款易洗脫的抗體親和填料，ee為Easy Elution的縮寫，意味該填料較傳統(tǒng)的蛋白G填料更容易洗脫，即洗脫的pH更高，FF為Fast Flow的縮寫，意味該填料可在高流速下工作。

易洗脫重組鏈球菌蛋白G配基由大腸桿菌表達，不含動物來源。ee-ProGNUPharose FF的基球與配基通過單點偶聯(lián)而成，加之對結合域的基因工程改造，其對h-IgG的動態(tài)結合載量高于40mg/mL，pH=4~5的條件可以將h-IgG較好的洗脫，較市面的蛋白G填料產(chǎn)品有載量高和易洗脫兩大優(yōu)勢。與蛋白A填料相比，蛋白G填料的優(yōu)勢在于可以與人類和小鼠所有IgG亞型結合。本產(chǎn)品對人、小鼠、大鼠、兔、牛等等來源的多種類 型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水、血清、細胞培養(yǎng)上清或細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)需求。

2 、產(chǎn)品特點與技術指標

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，6 min 停留時間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min停留時間的使用條件，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作；d 10 cm 柱高下的測試流速。

3、抗體親和層析簡介——易洗脫重組鏈球菌蛋白 G

ee-ProG NUPharose FF 的配基為重組鏈球菌蛋白G，與金黃色-葡萄球菌蛋白A一樣，其與IgG之間的親和作用也主要通過蛋白G結合域與Fc區(qū)之間的相互作用。在基因工程改造過程中，將鏈球菌蛋白G的白蛋白結合域去除，使得該配基與目標分子的特異性結合增強。野生型蛋白G的不同結合域對IgG的親和力不同，本產(chǎn)品的配基選取了親和力較弱的結合域并對之加以基因工程改造，達到了易洗脫的目的。蛋白A與IgG之間的親和作用包括在IgG生理條件的溶液狀態(tài)下的疏水相互作用、極性相互作用和氫鍵，蛋白G與IgG之間的親和作用是以疏水相互作用為主。一般需要降低pH將親和作用破壞后進行洗脫，例如pH=3的甘-氨酸、檸檬酸鹽和乙酸鹽等。對于本產(chǎn)品，pH=4~5的條件可以將IgG較好的洗脫，比市面上常見的蛋白G填料的洗脫pH高1個單位左右。下表為蛋白A和蛋白G對不同哺乳動物不同亞型抗體的結合情況。注：-表示不結合；+表示微弱結合；++表示中等結合4.5 在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱；+++表示很強結合。

4 、使用方法參考 

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮 比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。ee-ProGNUPharose FF的壓縮比為1.15。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2 柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

柱效測定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進行，按照下表配制樣品溶液和流動相。 

根據(jù)UV或者電導率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對稱因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L為柱高；VR為保留體積；Wh 為半高峰寬；a為在10%峰高處的個半峰寬；b為在10%峰高處的第二個半峰寬。

一般來說，HETP的數(shù)值應小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為填 料的平均粒徑），As應在0.8~1.5之間。

4.3 平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。有時也選擇不添加NaCl。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A，以電導、pH 等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液A對應為準。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL填料"來設定，通常為DBC10%的50~80%，例如ee-ProGNUPharoseFF產(chǎn)品對人IgG的DBC10%為~40mg/mL上樣量可控制為20~32 mg/mL。在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對樣品進行離心（10000 g以上）、過濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液A再平衡層析柱。

4.4 洗脫與再生（Elution & Regeneration）

一般的蛋白G填料，最-常用的洗脫方式為pH=3的甘-氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽，蛋白G與一些IgG之間的結合力更強，有時需要將pH降低至2.5才能完-全洗脫。但該pH較低，可能會使一些抗體失活或聚集。本產(chǎn)品通常在pH=4~5時，IgG可被較好洗脫。

于不同類型的IgG，最高的洗脫pH會有差異。倘若pH=4~5對IgG仍太低，也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時間。洗脫之后，可用5~10個柱體積的洗脫液對色譜柱進行再生。

4.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高，或有蛋白與填料強烈結合無法洗脫，或有沉淀、變性蛋白時，需要對填料進行在位清洗，可采用以下方法去除雜質，反向清洗效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜，不可凍存。